Определение резус-фактора крови

Определение группы крови с помощью цоликлонов — алгоритм и интерпретация результатов

Определение группы эритроцитарных антигенов и резус-фактора давно стало одним из обязательных исследований для большинства пациентов, поступающих на стационарное лечение. Его проведение возможно на любом уровне оказания медицинской помощи при условии наличия необходимых реагентов и инструментов.

Обычно, определение группы проводится с помощью стандартных сывороток, хотя, конкуренцию ему составляет еще один метод, сходный по методике проведения с эталонным – использование цоликлонов.

Цоликлон – моноклональное антитело, образующееся путем генной инженерии. Чаще всего, для его получения используют мышей – животному вводят специальный антиген, а после получают асцитную жидкость грызуна, в которой и содержатся указанные антитела.

Морфологически, они относятся к иммуноглобулинам класса М, т.е. антителам острой фазы. Механизм действия их обусловлен образованием комплекса антиген-антитело, где в качестве антигена выступают некоторые молекулы (в данной ситуации – белки, определяющие группу крови и ее резус), расположенные на мембране клетки.

Определение резус фактора экспресс методом с помощью стандартного универсального реагента без подогрева в пробирке

Для определения резус-фактора может быть использована свежая не свернувшаяся кровь, взятая из пальца непосредственно перед исследованием, или консервированная, без всякой предварительной обработки, а также эритроциты из пробирки после образования сгустка и отстаивания сыворотки.

Техника определения.

1мл стандартного универсального реагента (антирезусная сыворотка группы AB(IV)+33% раствор полиглюкина);

-1мл исследуемой крови(эритроцитов)

На дно пробирки внести 1 каплю стандартного универсального реагента и 1 каплю исследуемой крови (или эритроцитов).

Содержимое пробирки перемешать встряхиванием и затем медленно поворачивать, наклоняя пробирку почти до горизонтали таким образом, чтобы содержимое растекалось по её стенкам. после 3-минутного покачивания ,

для исключения неспецифической агрегации эритроцитов в пробирку добавить 2-3мл физиологического раствора хлористого натрия и перемешать, не взбалтывая, путём 2-3-х кратного перевёртывания пробирки. Оценку производить визуально.

Оценка результата.

Резус-(+) -наличие агглютинации в виде крупных хлопьев из эритроцитов на фоне просветлённой жидкости .

Резус-(-) -отсутствие агглютинации (в пробирке гомогенно окрашенная жидкость).

Определение резус-фактора с помощью моноклонального реагента (цоликлон анти-d , анти-d супер).

Цоликлон анти-D супер выпускается во флаконах по 2,5 или 10 мл (1 мл содержит 10 доз). Срок хранения — 1 год в холодильнике при t 2~8 °С. Вскрытый флакон можно хранить в холодильнике в течение месяца в закрытом виде

Наносят большую каплю (около 0,1 мл) реагента на пластинку или планшет.

Рядом помещают маленькую каплю (0,01-0,05 мл) исследуемой крови и смешивают кровь с реагентом.

Реакция агглютинации начинает развиваться через 10-15 сек, четко выраженная агглютинация наступает через 30-60 сек.

Результаты реакции считывают через 3 мин.

Тарелку после смешивания реагента с кровью рекомендуется покачивать не сразу, а через 20-30 сек, что позволяет за это время развиться более полной крупнолепестковой агглютинации.

Метод агглютинации на чашках Петри.

– исследуемые эритроциты;

-две серии стандартных сывороток антирезус всех групп системы АВО;

-контрольные образцы резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов:

-водяная баня с постоянной температурой 46-48 С°

-чашки Петри

Наличие агглютинации свидетельствует о положительном результате, отсутствие ее – об отрицательном. Для контроля в этом методе используют заведомо Rh-отрицательные и Rh-положительные эритроциты.

Метод агглютинации с 10% желатином:

Реакция конглютинации с желатиной обычно проводится в пробирках емкостью 8—10 мл. В штатив устанавливают 2 ряда пробирок для двух различных серий стандартной сыворотки. В контрольные пробирки каждого ряда вводят по 1 капле стандартных резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов, в остальные пары пробирок — исследуемые эритроциты. Исследование можно проводить как с отмытыми, так и с неотмытыми эритроцитами.

Затем в каждую пробирку добавляют по одной капле подогретой до разжижения желатины (10% раствор) и по одной капле стандартной сыворотки. Содержимое пробирок смешивают путем встряхивания и помещают в водяную баню при t° 46—48° на 5 мин., по истечении которых в каждую пробирку доливают 5—8 мл подогретого до t° 46—48° физиологического раствора NaCl и рассматривают на свет, определяя наличие или отсутствие агглютинации (рис. 2).

Метод агглютинации в солевой среде.

При исследовании сывороткой, содержащей полные антитела, применяют метод агглютинации в солевой среде в маленьких пробирках (высотой 2—2,5 см, диаметром 0,5 — 0,6 см).

В штатив устанавливают 2 ряда пробирок (по количеству исследуемых образцов и по 2 для контроля), в которые вводится по 2 капли стандартной сыворотки и по 1 капле 2% взвеси эритроцитов, предварительно дважды отмытых физиологическим раствором NaCl.

Содержимое пробирок встряхивают и помещают в термостат при t° 37° на 1 час.

О резус-принадлежности судят по форме осадка, который рассматривают через лупу с 5—7-кратным увеличением над источником света, закрытым матовым стеклом. Результаты учитывают в зависимости от наличия или отсутствия агглютинации в исследуемых эритроцитах после проверки контрольных образцов.

studopedia.ru>

Полезные советы

Определение группы и резус-фактора крови с использованием цоликлонов считается одним из самых простых и доступных методов, поэтому широко применяется в лабораториях разного уровня. Кроме того, такой анализ дает достоверные результаты. Однако в некоторых случаях они бывают ложными, а причиной этому становится несоблюдение нескольких правил. Простая инструкция по применению цоликлонов и работа с ними позволит избежать получения недостоверных результатов и необходимости проводить исследование заново:

  • хранить реагенты в холодильнике, при температуре от 2 до 8 градусов, а распечатанный флакон использовать в течение 30 суток;
  • исследования проводятся при комнатной температуре, а в слишком жарком помещении рекомендуется периодически охлаждать стеклянную поверхность планшета;
  • обозначать на планшете разные цоликлоны маркером, поскольку их цвет после добавления крови быстро исчезает;
  • соблюдать правильные пропорции реагентов: если крови будет слишком много, реакция агглютинации эритроцитов будет мало выражена;
  • не допускать смешивания капель жидкости, в которых уже присутствуют разные типы цолкиклонов — в таком случае реакцию придется проводить заново;
  • обозначать окончательный результат не менее, чем через 3 минуты после начала реакции.

Важно также соблюдать последовательность действий во время анализа. Так, если стеклянную поверхность не раскачивать, даже при отсутствии реакции склеивания эритроциты будут расположены в краевой зоне капли

Это может стать причиной неправильной интерпретации результатов. При определении группы крови необходимо учитывать острые и хронические заболевания, которые наблюдаются у пациента. При патологиях печени и органов кроветворной системы, а также болезнях, которые протекают по типу сепсиса, может происходить явление патагглютинации. Эритроциты будут склеиваться даже при контакте с обычным физиологическим раствором. Напротив, при лейкозе кровяные клетки не отреагируют на присутствие антител, и агглютинация не произойдет.

Цоликлоны — это важные реагенты, которые используются ежедневно в гематологических лабораториях. Они позволяют быстро и безошибочно определить группу крови и ее резус без дополнительного оборудования и специальных навыков

Однако важно выполнять простой алгоритм, чтобы результаты анализа действительно были достоверными

Техника постановки пробы на резус совместимость с полиглюкином

Цель:определить совместимость донорской крови с кровью реципиента по резус принадлежности.

Показания:гемотрансфузия.

Приготовить:донорская кровь, 33% раствора полиглюкина, сыворотка крови реципиента, стеклянные палочки, пипетки, чашка Петри, шприц, игла, стерильные марлевые шарики, спирт, стерильный пинцет, стерильные перчатки, песочные часы, водяная баня.

Алгоритм действия:

  1. На дно пробирки внести 2 капли сыворотки больного, 1 каплю крови донора и 1 каплю 33% полиглюкина;
  2. Встряхнуть пробирку;
  3. Пробирку наклонить почти горизонтально и медленно поворачивать вокруг оси в течении 5 минут;
  4. Долить в пробирку 3-4 мл изотонического раствора хлорида натрия;
  5. Перемешать путем 2-3 кратного переворачивания пробирки ( не взбалтывать!);
  6. Посмотреть на свет и оценить результат;
  7. Если есть реакция агглютинации на фоне просветленной жидкости, то кровь переливать нельзя!;
  8. Если агглютинации не произошла, то реакция отрицательная и кровь переливать можно.

Примечание: температура воздуха должна быть в пределах 15- 25о С для профилактики ложной агглютинации.

Техника постановки биологической пробы

Цель: для определения совместимости крови донора и реципиента.

Показания:гемотрансфузия.

Приготовить:донорская кровь, систему для переливания крови, стерильные марлевые шарики, спирт, стерильный пинцет, стерильные перчатки.

Алгоритм действия:

  1. Перелить струйно 10-15 мл крови или кровезаменителей внутривенно;
  2. Закрыть систему на 3 минуты;
  3. Оценить состояние пациента;
  4. Перелить струйно 10-15 мл крови или кровезаменителей внутривенно;
  5. Закрыть систему на 3 минуты;
  6. Оценить состояние пациента;
  7. Перелить струйно 10-15 мл крови или кровезаменителей внутривенно;
  8. Оценить состояние пациента.

Примечание:При появлении болей в животе, груди, пояснице, рвоте, головной боли, одышке, тахикардии, сыпи на коже – кровь или кровезаменители вводить нельзя!

studopedia.ru>

Что такое цоликлон

Цоликлоны для определения группы крови представляют собой антитела, получаемые по специальной технологии. Чтобы получить цоликлоны, используют лабораторных подопытных крыс. Грызунам делают инъекцию специального средства, а затем берут кровь из брюшины, она включает вещества, которые нужны для анализа.

Цоликлоны по своему составу относятся к иммуноглобулинам, они реагируют с антигенами, находящимися на оболочке эритроцитов. Типы этих веществ используются для выявления группы. Во время анализа цоликлоны разных видов вступают в реакцию с агглютиногенами, это дает возможность выявить группу и резус-фактор человека.

Цоликлоны отличаются преимуществом перед другими сыворотками, т.к. не требуют долгой подготовки к обследованию и дают возможность сделать его быстро. Они не представляют собой человеческие клетки, ввиду чего при контакте с ними медики не смогут заразиться какой-либо инфекцией.

Плюсы и минусы методов

Если говорить о каждом конкретном методе проверки группы крови, то можно выявить следующее:

  • Плюс перекрёстного метода в его контрольной направленности, то есть он имеет особенность предотвращать главные ошибки при диагностировании группы крови другими стандартными способами;
  • Плюс способа с применением цоликлонов заключается в его возможности применения в случаях, когда стандартные сыворотки не могут быть применены. Минус же заключается в сложности проведения, соблюдении всех условий для оптимального проведения процедуры;
  • Эритротесты хороши тем, что доступны и для домашнего использования, но отрицательной их стороной считается неидеальная результативность, то есть итог может быть некорректным.

Перечисленные методики в общей характеристике в равной степени обладают теми или иными положительными и отрицательными сторонами.

Среди них можно выделить минусы:

  • Возможность ошибки – даже при проведении сложной и оправданной методики могут появляться ошибочные результаты.
  • Обязательное соблюдение правил – многие методики должны проводиться в специальных условиях, требующих тщательной подготовки и соблюдения определённых параметров помещения, его температуры и влажности. Реагенты должны корректно храниться, что тоже накладывает свои трудности на практику проведения исследования.

Среди плюсов выделяют:

  • Многие из данных методик точны, позволяют получить правильный результат с точностью до 100% (особенно это касается способа с применением цоликлонов).
  • Быстрота выполнения – для проведения анализа и ожидания времени воздействия реагентов на кровь не уходит много времени, обычно продолжительность реакции составляет не более 5-ти минут.
  • Возможность определения родства при анализе крови на принадлежность к группе.

15. Определение резус-фактора с помощью цоликлона:

  1. Поместите каплю цоликлона «анти-Д» на тарелку или пластину.

  2. Капля цоликлона должна быть в 10 раз больше капли исследуемой крови /цоликлон – 0,1мл, кровь – 0,01мл/.

  3. Тщательно смешайте цоликлон с исследуемой кровью.

  4. Наблюдайте реакцию от 2-5мин. Положительный результат выражается в агглютинации эритроцитов. При отрицательном результате капли остаются равномерно окрашенными в красный цвет и агглютинация в них не наблюдается.

16. Алгоритм дезинфекции планшета для определения групп крови.

  1. Лунки планшета, в которых определяли группы крови, залейте 3% раствором хлорамина или другим дезинфицирующим средством, разрешенным для работы в вашей лаборатории, на 1 час.

  2. Через 1 час смойте дезинфицирующее средство проточной водой.

  3. Протрите планшету сухой ветошью.

17. Определите длительность кровотечения капиллярной крови по Дуке:

  1. Подсчитайте количество капель крови на фильтровальной бумаге.

  2. Полученный результат умножьте на 30сек.

  3. Полученный результата сравните с нормой.

/Длительность кровотечения – показатель, характеризующий первичный тромбоцитарно-сосудистый гемостаз. Норма – от 2 до 4мин./.

18. Подсчитайте количество эритроцитов в камере Горяева:

  1. К боковым полям камеры Горяева плотно притрите покровное стекло.

  2. Стекло притирается легким нажимом на боковые края большими пальцами правой и левой руки до появления радужных колец Ньютона.

  3. Заполните камеру Горяева с помощью стеклянной палочки или Пастеровской пипетки, предварительно тщательно перемешав жидкость в пробирке, чтобы взвесь форменных элементов была равномерной./При заполнении камеры жидкость не должна попадать в борозды и в камере не должно быть пузырьков воздуха/.

  4. После заполнения камеры оставьте ее стоять на 1-2мин на предметном столике микроскопа, чтобы элементы крови осели на дно камеры и движение их прекратилось.

  5. Настройте микроскоп для работы – подсчет ведите под малым увеличением опущенным конденсором и прикрытой диафрагмой.

  6. Подсчитайте число эритроцитов в пяти больших квадратах, расположенных по диагонали, каждый из которых разграфлен на 16 малых квадратиков.

  7. Полученное число эритроцитов умножьте на 10000 – получите количество эритроцитов в 1мм кубическом. В норме количество эритроцитов у женщин 3,9 – 4,7 на 10 в 12 степени на литр. У мужчин – 4,0 – 5, 0 на 10 в 12 степени на литр.

19. Подсчитайте количество лейкоцитов в камере Горяева:

  1. К боковым полям камеры Горяева плотно притрите покровное стекло.

  2. Стекло притирается легким нажимом на боковые края большими пальцами правой и левой руки до появления радужных колец Ньютона.

  3. Заполните камеру Горяева с помощью стеклянной палочки или Пастеровской пипетки, предварительно тщательно перемешав жидкость в пробирке, чтобы взвесь форменных элементов была равномерной. /При заполнении камеры жидкость не должна попадать в борозды и в камере не должно быть пузырьков воздуха/.

  4. После заполнения камеры оставьте ее стоять на 1-2мин на предметном столике микроскопа, чтобы элементы крови осели на дно камеры и движение их прекратилось.

  5. Настройте микроскоп для работы – подсчет ведите под малым увеличением опущенным конденсором и прикрытой диафрагмой.

  6. Подсчитайте число лейкоцитов в ста больших не разграфленных квадратах, которые располагаются по четыре квадрата.

  7. Полученное число лейкоцитов умножьте на 50 – получите количество лейкоцитов в 1мм кубическом. В норме количество лейкоцитов в 1мм кубическом равно от 4-х до 9-ти тысяч, т.е. от 4 до 9х 10 в 9 степени на литр.

StudFiles.ru>

Для чего проводится анализ

Группа и резус-фактор – генетически обусловленные характеристики крови, которые наследуются от родителей и остаются неизменными на протяжении всей жизни человека. Классификация групп крови осуществляется, исходя из определенного набора биохимических параметров и состава антигенов, и насчитывает 4 основных группы. Переливание пациенту крови несовместимой группы или с другим резус-фактором несет с собой смертельную опасность – иммунная система начинает вырабатывать антитела против чужеродных клеток, которые атакуют и разрушают их. Именно по этой причине в ситуациях, которые несут с собой риск обширной кровопотери, необходимо точное определение принадлежности крови и резус-фактора как у донора, так и у реципиента.

Определение группы крови и резус фактора

Практически сразу после рождения у ребенка берется анализ крови на группу крови и резус-фактор. Эти данные остаются неизменными на всю жизнь. Однако не всегда родители запоминают группу крови и резус малыша.

Следовательно, не могут их сообщить, когда ребенок повзрослеет. Поэтому многие люди самостоятельно сдают анализ на группу крови и Rh. Современная медицина предлагает несколько методов определения группы крови и резус-фактора.

Вот самые популярные из них.

Цоликлоны для определения группы крови и резуса

Узнать группу крови можно с помощью цоликлонов. Этот довольно новый метод позволяет получить практически 100% достоверный результат.

Цоликлонами называются моноклинальные антитела, которые синтезированы благодаря разработкам генной инженерии из жидкой ткани стерильных мышей. Они используются для того, чтобы выявить, какая группа у крови по системе АВО.

Такой вид анализа выполняется в условиях лаборатории. Для получения достоверного результата во время исследования должны быть соблюдены ряд правил. Прежде всего, температура воздуха в помещении, где проводятся анализы, не должна быть ниже +15 градусов по Цельсию и выше +25 градусов по Цельсию.

Также в лаборатории должно быть хорошее освещение. Для выполнения анализа используются только качественные реагенты. Они не должны иметь замутнения и содержать хлопья. Для каждого реагента должна быть применена отдельная пипетка, чтобы не допустить смешивание.

Алгоритм действия в данном случае будет следующим. На двух противоположных сторонах тарелки выполняются надписи анти-А и анти-В, под которые лаборант помещает по 0,1 мл соответствующего цоликлона. Определить их можно по оттенку.

Так, у цоликлона анти-А он желто-розовый, а анти-В – синий. Далее, под реагент помещается капля крови. С помощью стеклянной палочки обе субстанции смешиваются.

После этого берется чистая палочка, и такая манипуляция выполняется с двумя другими субстанциями.

Если же процесса агглютинации нет, то цоликлон приобретает красный цвет. После этого происходит определение группы крови:

  • Если агглютинация не идет ни с одной, ни с другой стороны тарелки, то в эритроцитах нет антигенов А и В, следовательно, кровь принадлежит к первой группе.
  • Если агглютинация происходит только там, где присутствовал цоликлон анти-А, то в форменных клетках крови (эритроцитах) присутствует лишь антиген А. Следовательно, кровь принадлежит второй группе.
  • Если агглютинация происходит только там, где присутствовал цоликлон анти-В, то в форменных клетках крови (эритроцитах) присутствует лишь антиген В. Следовательно, кровь принадлежит к третьей группе.
  • Если процесс агглютинации идет в обоих случаях, то в эритроцитах есть антигены А и В. В такой ситуации рекомендуется сделать дополнительный анализ. Для его проведения берется капля крови пациента и смешивается с изотоническим раствором хлорида натрия в количестве 0,1 мл. Если при этом агглютинация не наблюдается, то определяют четвертую группу крови.

Данным методом можно также определить резус-фактор. Алгоритм будет таким же, как и при определении группы крови.

На белую тарелку помещается цоликлон анти-D, а рядом с ним капля крови пациента. Она должна быть в 10 раз меньше реагента. Обе субстанции смешиваются и в том случае, если агглютинация началась, то определяется положительный резус-фактор, в том случае, если нет, то резус-фактор отрицательный.

Методика определение группы крови по системе АВО

Как определить группу крови по системе АВО? Методика распознания группы крови и резус-фактора по системе АВО не менее популярна, чем предыдущая. Исследование также проводится в лабораторных условиях. Техника выполнения анализа по системе АВО проста.

К ним добавляются капли крови, размеров раз в 10 меньше. Затем, субстанции смешиваются, и наблюдается реакция. Спустя 5 минут, лаборант может начать расшифровку. Оценивается агглютинация, при которой возникают хлопья, а сыворотка становится бесцветной.

Метод АВО выдает такие результаты:

  • агглютинации нет нигде, следовательно, у человека первая группа крови;
  • агглютинация идет в сыворотках О и В, значит, кровь 2 группы;
  • агглютинация идет в сыворотках О и А, значит, кровь 3 группы;
  • агглютинация идет во всех сыворотках АВО, значит, требуется дополнительное исследование, в котором будет задействована сыворотка для определения четвертой группы. Если в данном случае процесс агглютинации не состоялся, значит, исследуемая кровь относится к 4 группе.

Суть метода

Определяют группу с помощью изогемагглютинирующих средств — лабораторных реагентов. Исследование проводится, когда смешивают реагент с нативной кровью, и при добавлении раствора натрия хлорида (0,9%).

В процессе исследования изучается, какие антитела (антигены) имеются у натива, а какие отсутствуют. Таким образом и определяется, какая кровь — 0, А, В или АВ.

В каждой группе свой набор агглютиногенов (антигенов) и агглютининов (антител):

  • 1 (или нулевая) — на поверхности красных кровяных телец присутствует антитело A и антитело B. При этом полностью отсутствуют антитела в сыворотке. Поэтому реакции агглютинации не происходит.
  • 2 — есть в крови агглютинин B (антитело), агглютиноген (антиген) А.
  • 3 — наличествует антиген В и антитело A.
  • 4 — присутствуют оба белка (2 антитела), и нет ни одного антигена. Она является наименее распространенной — около 8% населения.

Определение группы крови по стандартным сывороткам необходимо для того, чтобы при переливании агглютинация ни привела к летальному исходу того, кто подвергся гемотрансфузии. Реакция агглютинации, т. е. склеивания, происходит тогда, когда при попадании сыворотки на эритроциты натива начинается процесс уничтожения этих телец.

Склеиваться клетки будут при взаимодействии антигена А и антитела A. И при взаимодействии антигена В и антитела B. При агглютинизации в пробе всегда появляются хлопья — склеенные между собой красные клетки.

Метод перекрестной реакции

Данная техника заключается в определении агглютиногенов с помощью цоликлонов или стандартных сывороток с параллельным выявлением агглютининов при помощи эталонных эритроцитов.

Методика проведения практически не отличается от определения группы крови при помощи сывороток, однако, есть некоторые дополнения.

На планшетку ниже нанесенных сывороток добавляют по одной малой капле стандартных эритроцитов. После этого, из пробирки, содержащей прошедшую через центрифугу кровь пациента, извлекают с помощью пипетки плазму, которую добавляют к стандартным эритроцитам, а находящиеся на дне ее эритроциты вносят в стандартную сыворотку.

Также как и при методике стандартных сывороток, полученные результаты оценивают через несколько минут после начала реакции. При наличии агглютинации в стандартных сыворотках судят о наличии агглютининов системы АВ0, а при развитии реакции плазмы со стандартными эритроцитами – об имеющихся агглютиногенах.

Результаты исследования с применением сывороток и стандартных эритроцитов

Перекрестный метод получил широкое распространение благодаря тому, что он предотвращает основные диагностические ошибки при определении крови стандартными методиками.

Подготовка к исследованию

Для проведения процедуры необходима хорошо освещенная лаборатория. Помещение должно быть защищено от насекомых, пыли, грязи, волос. Надо поддерживать температуру в пределах +15+25. Внимательно следят за влажностью. О необходимой влажности можно прочитать в инструкции на упаковке цоликлонов. В таких условиях анализ получится более достоверным. Обязательно наличие чистой медицинской одежды, специальных перчаток и головного убора.

Применяемые инструменты, чтобы определить группу крови:

  • цоликлоны антиА и антиВ;
  • материал для исследования;
  • планшет для анализа;
  • стеклянные палочки (стерильные);
  • раствор натрия хлорида;
  • пипетка, стерильная;
  • посуда или миска с раствором хлорамина 3%;

Расшифровка и забор анализа проводится в лаборатории. Для определения группы крови алгоритм действий следующий. Надо налить цоликлоны по 1 капле в отсеки на планшете. Внести пипеткой капли крови рядом, избегая контакта пипетки и образца. Стеклянными палочками перемешать цоликлоны и кровь. Смешивать субстанции надо покачивая из стороны в сторону, аккуратно. Наблюдать реакцию можно через 2,5 минуты.

Далее вносят пипеткой в отсеки, где произошла агглютинация по 1 капле раствора натрия. Смешивают также, покачивая. После чего наблюдают изменения.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *