Определение группы крови

Определение групп крови стандартными методами

Существует множество различных техник, но в клинических лабораториях чаще всего используют методику стандартных сывороток. Как определить группу крови по стандартным сывороткам?

Этот метод применяется для определения антигенов системы АВ0. Стандартная изогемагглютинирующая сыворотка имеет в своем составе набор специфических антител к поверхностным молекулам эритроцитов. При наличии антигена, на которое распространяется действие антител, происходит образования комплекса антиген-антитело, что провоцирует запуск каскада иммунных реакций. Ее результат — агглютинация эритроцитов, на основании характера агглютинации судят можно сделать заключение об отнесении образца к той или иной группе крови.

Разведение проводится следующим образом – в пробирку с 1 мл 0.9 процентного раствора пищевой соли добавляют 1 мл плазмы и тщательно перемешивают раствор. После, пипеткой отбирают 1 мл полученного раствора плазмы и добавляют его во вторую пробирку, содержащую изотонический раствор. Таким образом, достигается разведение плазмы в соотношении 1:256. Использование других разведений может привести к появлению диагностической ошибки.

Техника проведения исследования следующая – на специальный планшет для определения группы крови помещают по одной капле (общим объемом около 0.1 мл) каждой сыворотки в область с соответствующей пометкой (используются сыворотки двух образцов, среди которых один является контрольным, а второй используется для исследования). После этого, возле каждой капли сыворотки помещают исследуемый образец (0.01 мл), после чего он по отдельности смешивается с каждым видом диагностикума.

Через некоторое время (в среднем, около 5 минут) проводят анализ полученных результатов с описанием характера произошедшей реакции:

• если в исследуемом образце происходит агглютинация – тест положительный;
• если агглютинации нет, то реакция отрицательна.

Проще говоря, наличие агглютинации говорит о том, что в крови имеется необходимый набор агглютиногенов, и если она произошла, значит кровь принадлежит к той группе, антитела к которой содержатся в сыворотке. На основании полученных результатов строится таблица или схема, которая визуально отображает результаты.

Таблица результатов теста на группу крови с применением стандартных сывороток

Определение группы крови и резус фактора

Практически сразу после рождения у ребенка берется анализ крови на группу крови и резус-фактор. Эти данные остаются неизменными на всю жизнь. Однако не всегда родители запоминают группу крови и резус малыша.

Следовательно, не могут их сообщить, когда ребенок повзрослеет. Поэтому многие люди самостоятельно сдают анализ на группу крови и Rh. Современная медицина предлагает несколько методов определения группы крови и резус-фактора.

Вот самые популярные из них.

Цоликлоны для определения группы крови и резуса

Узнать группу крови можно с помощью цоликлонов. Этот довольно новый метод позволяет получить практически 100% достоверный результат.

Цоликлонами называются моноклинальные антитела, которые синтезированы благодаря разработкам генной инженерии из жидкой ткани стерильных мышей. Они используются для того, чтобы выявить, какая группа у крови по системе АВО.

Такой вид анализа выполняется в условиях лаборатории. Для получения достоверного результата во время исследования должны быть соблюдены ряд правил. Прежде всего, температура воздуха в помещении, где проводятся анализы, не должна быть ниже +15 градусов по Цельсию и выше +25 градусов по Цельсию.

Также в лаборатории должно быть хорошее освещение. Для выполнения анализа используются только качественные реагенты. Они не должны иметь замутнения и содержать хлопья. Для каждого реагента должна быть применена отдельная пипетка, чтобы не допустить смешивание.

Алгоритм действия в данном случае будет следующим. На двух противоположных сторонах тарелки выполняются надписи анти-А и анти-В, под которые лаборант помещает по 0,1 мл соответствующего цоликлона. Определить их можно по оттенку.

Так, у цоликлона анти-А он желто-розовый, а анти-В – синий. Далее, под реагент помещается капля крови. С помощью стеклянной палочки обе субстанции смешиваются.

После этого берется чистая палочка, и такая манипуляция выполняется с двумя другими субстанциями.

Если же процесса агглютинации нет, то цоликлон приобретает красный цвет. После этого происходит определение группы крови:

• Если агглютинация не идет ни с одной, ни с другой стороны тарелки, то в эритроцитах нет антигенов А и В, следовательно, кровь принадлежит к первой группе.
• Если агглютинация происходит только там, где присутствовал цоликлон анти-А, то в форменных клетках крови (эритроцитах) присутствует лишь антиген А. Следовательно, кровь принадлежит второй группе.
• Если агглютинация происходит только там, где присутствовал цоликлон анти-В, то в форменных клетках крови (эритроцитах) присутствует лишь антиген В. Следовательно, кровь принадлежит к третьей группе.
• Если процесс агглютинации идет в обоих случаях, то в эритроцитах есть антигены А и В. В такой ситуации рекомендуется сделать дополнительный анализ. Для его проведения берется капля крови пациента и смешивается с изотоническим раствором хлорида натрия в количестве 0,1 мл. Если при этом агглютинация не наблюдается, то определяют четвертую группу крови.

Данным методом можно также определить резус-фактор. Алгоритм будет таким же, как и при определении группы крови.

На белую тарелку помещается цоликлон анти-D, а рядом с ним капля крови пациента. Она должна быть в 10 раз меньше реагента. Обе субстанции смешиваются и в том случае, если агглютинация началась, то определяется положительный резус-фактор, в том случае, если нет, то резус-фактор отрицательный.

Методика определение группы крови по системе АВО

Как определить группу крови по системе АВО? Методика распознания группы крови и резус-фактора по системе АВО не менее популярна, чем предыдущая. Исследование также проводится в лабораторных условиях. Техника выполнения анализа по системе АВО проста.

К ним добавляются капли крови, размеров раз в 10 меньше. Затем, субстанции смешиваются, и наблюдается реакция. Спустя 5 минут, лаборант может начать расшифровку. Оценивается агглютинация, при которой возникают хлопья, а сыворотка становится бесцветной.

Метод АВО выдает такие результаты:

• агглютинации нет нигде, следовательно, у человека первая группа крови;
• агглютинация идет в сыворотках О и В, значит, кровь 2 группы;
• агглютинация идет в сыворотках О и А, значит, кровь 3 группы;
• агглютинация идет во всех сыворотках АВО, значит, требуется дополнительное исследование, в котором будет задействована сыворотка для определения четвертой группы. Если в данном случае процесс агглютинации не состоялся, значит, исследуемая кровь относится к 4 группе.

Стандартное определение группы крови (простой метод)

Для проведения анализа на группу крови нужны эритроциты пациента (берутся из капли крови) и стандартные сыворотки, содержащие известные антигены.

Сыворотки изготавливаются из донорской крови на «Станциях переливания», имеют сроки годности, требуют соблюдения условий хранения. На ампулах указывается номер серии. Для точного анализа берется два набора сывороток разных серий. Это делается с целью исключения ошибок.

На плоской тарелке двумя рядами помещают по крупной капле четырех сывороток (достаточно только III и II, но для контроля берется еще 1 и 1V)

Разными стеклянными палочками (удобно пользоваться глазными пипетками) в капли сывороток вносят исследуемую кровь (соотношение должно получиться примерно 1:10) и осторожно помешивают

Пять минут тарелку покачивают, давая возможность сывороткам хорошо перемешаться с кровью.

Достоверность методик

В некоторых случаях при определении группы крови могут возникать ошибки, имеющие различный характер.

Технические ошибки:

Неправильное расположение реагентов — может нарушить корректность проведения анализа, так как спутаются все результаты

Перед применением важно изучить планшет с реагентами на наличие ошибок или некачественности самих реагентов. Несоблюдение температурного режима – исследование проводится при температуре не выше 25 градусов и не ниже 15 градусов, так как в крови могут содержаться агглютинаты, склеивающие эритроциты при недостатке тепла, а при его избытке антитела А, В и АВ могут терять свою активность

Нарушение количественного соотношения исследуемого материала и реагентов — приводит к ошибкам в результатах. Если количество эритроцитов значительно выше числа реагентов, агглютинация может пройти практически незаметно; если количества эритроцитов недостаточно, реакция проявляется слишком медленно и приводит к некорректной расшифровке результата. Несоблюдение времени наблюдения — приводит к некорректной расшифровке. Реакция может появиться спустя 10-15 секунд, что может быть рассмотрено в качестве результата, но для точной результативности важно выждать не менее 5-ти минут, так как слабый антиген А характеризуется замедленной реакцией. Несоблюдение подвижности смеси – при этом эритроциты могут осесть и дать неправильный результат при оценивании. Планшетную поверхность нужно постоянно покачивать.

Функциональные и другие ошибки:

1. При определении трудноопределимой группы крови могут появиться ошибки. Так как эритроциты А2 низкоагглютинативны, их определение может вызвать ряд сложностей и появление последующих ошибочных результатов.
2. Неспецифическая агглютинация эритроцитов – данное отклонение может наблюдаться у пациентов, страдающих анемией или иными аутоиммунными заболеваниями, у младенцев с гемолитическими патологиями.
3. Неспецифическую агглютинацию можно спутать со специфической, поэтому для проверки проводится проба с сывороткой АВ. Делается это для корректного подбора донора.
4. Наличие кровяных химер – эритроцитов, которые отличаются по показаниям, но находятся в одном кровяном русле. Возникает при частом переливании крови, у близнецов и после пересадки костного мозга.
5. При наличии определённых патологий (цирроз печени, сепсис, ожоги) может наблюдаться повышенная агглютинация, что спутывает результаты анализов. При лейкозе обратная ситуация – снижение агглютинабельности.

Роль агглютинации важна в медицине.

С помощью неё выявляется группа крови, патологии. Подобные анализы крови помогают сохранить многим людям жизнь, так как правильный подбор всех параметров крови — резус-фактора и группы — очень важен при переливаниях и проведении оперативных вмешательств.

Определение групп крови с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток

Оснащение: набор стандартных изогемагглютинирующих сывороток I-IV групп крови двух различных серий, белые фарфоровый или эмалированный планшет со смачиваемой поверхностью, на котором расположено 8 (или 7) лунок, маркированных 0(I), А (II), B(III), AB(IV), 0,9% раствор хлорида натрия, пипетки, стеклянные палочки.

Техника выполнения. Процедура проводится в хорошо освещённом помещении при температуре воздуха от 15 до 25 ºС. На планшет под соответствующую маркировку наносят сыворотки I, II, III групп крови в объеме ~ 0,1 мл. Кровь у больного берут из пальца или из вены и добавляют по ~ 0,01 мл (малая капля) к сыворотке. Кровь и сыворотка смешиваются стеклянными палочками. Ожидание реакции гемагглютинации 0,5-5 минут. В те капли, где произошла агглютинация добавляют по 1 капле изотонического раствора, после чего производят учёт результатов пробы согласно приведённой ниже схеме.

Рис. 61. Схема учёта результатов пробы при определении группы крови с помощью набора стандартных сывороток. На схеме обозначено: + агглютинация, – агглютинация отсутствует.

Обращаем внимание, что проба с сывороткой IV группы (не содержащей никаких агглютиногенов) проводится только при наличии агглютинации во всех трёх лунках на планшете для подтверждения определения IV группы путём исключения неспецифической агглютинации

Рис. 62. Внешний вид эмалированного планшета, соответствующего группе крови В(III).

studopedia.ru>

Метод перекрестной реакции и метод цоликлонов

Методом простой реакции группу устанавливают с помощью лабораторной сыворотки. Второй способ — метод перекрестных реакций — делается лаборантом. Для его проведения используют стандартные эритроциты и плазму самого пациента. Ее добывают, когда в процессе центрифугирования тяжелые клетки отделяются от плазмы.

Для проверки понадобится 2 капли сыворотки после центрифугирования и отстоя не менее чем 1, 5 часа. В лабораторную планшетку опускают 2 капли добытого биологического материала и добавляют каплю со стандартными красными кровяными тельцами. В первую каплю плазмы помещают кровяные тельца с агглютиногенами 2 группы, а во вторую пробу — с антигенами третьей.

Метод перекрестной реакции считается контрольным и более достоверным. Реакция с эритроцитами оценивается следующим образом:

• Агглютинация есть и в 1, и во 2 капле. Это кровь обозначается как 0 или 1.
• Реакции нет в обеих случаях — это 4.
• Реакция склеивания там, где добавляли эритроциты второй категории — это 2. И, соответственно, 3 группа, где контрольные эритроциты третьего варианта.

Методы определения

Стандартный метод

Существует множество техник, однако в лаборатории обычно используют определение с помощью стандартных сывороток.

Результатом данной реакции является агглютинация эритроцитов, на основании характера происходящей агглютинации можно определить принадлежность образца к какой-либо группе.

Разведение производится так:

1. В пробирку, содержащую 1 миллилитр 0.9 %-го раствора пищевой соли, необходимо добавить 1 миллилитр плазмы. Раствор тщательно перемешать.

2. Затем пипеткой отбирают полученный раствор плазмы в объеме 1 миллилитр. Добавляют его в пробирку, которая содержит изотонический раствор. Так необходимо достигнуть разведения плазмы с соотношением 1 к 256. Применение других разведений несет риск возникновения диагностической ошибки.

Непосредственно исследование проводится таким образом:

1. На специальный планшет помещают по капле каждой сыворотки (общим объемом примерно 0.1 миллилитр) на участок, где имеется соответствующая пометка (применяются 2 образца, из них один – контрольный, второй предназначен для исследования).
2. Затем рядом с каждой каплей сыворотки размещают исследуемый образец в объеме 0.01 миллилитра, после чего его по отдельности смешивают с каждым диагностикумом.

Видео: Определение группы крови и резус-фактора

Здесь возможны варианты:

• Если реакции агглютинации нет в обеих пробах с сыворотками II и III (+ контрольные 1 и IV) — определение первой группы;
• Если свертывание наблюдается во всех пробах, кроме II — определение второй;
• При отсутствии реакции агглютинации только в пробе с III группы — определение III;
• Если свертываемость наблюдается во всех пробах, в том числе в IV-контрольной — определение IV.

В некоторых случаях склеивание неясно различимо. Тогда анализ необходимо переделать, мелкую агглютинацию наблюдают под микроскопом.

Метод перекрестной реакции

Суть этой техники состоит в определении агглютиногенов при помощи стандартных сывороток или цоликлонов с параллельным определением агглютининов с помощью эталонных эритроцитов.

На планшетку под сыворотками необходимо добавить по капле стандартных эритроцитов.

Результаты исследования крови с применением стандартных эритроцитов и сывороток:

+ агглютинация;

– агглютинация отсутствует;

— реакцию не проводят.

Определение группы крови цоликлонами

Цоликлоны — синтетические заменители сывороток, которые содержат в своем составе искусственные заменители агглютининов типов ά и β. Они называются эритротестами «Цоликлон анти-А» (имеют розовый цвет), а также «анти-В» (имеют синий цвет). Ожидаемая агглютинация наблюдается между агглютининами цоликлонов и эритроцитами крови.

Экспресс-методика с помощью набора «Эритротест-группокарт»

Хотя общепринятые способы определения принадлежности крови к конкретной группе распространены повсеместно, в современной медицине происходит внедрение экспресс-методов, самым распространенным из которых является “Эритротест”.

При определении группы с применением методики “Эритротест группокарт” необходим комплект инструментов, включающий следующие приборы:

• Планшетка, имеющая с пять лунок, для произведения определения группы по ее резус-принадлежности и системе АВ0;
• Скарификатор, предназначенный для получения образца, необходимого для исследования;
• Стеклянные палочки для перемешивания образцов;
• Чистая пипетка для набора растворов.

Все перечисленные инструменты необходимо для безошибочного проведения диагностики.

В лунках на планшетке расположены цоликлоны к антигенам (это цоликлоны анти-А, -В, -АВ) и к основному антигену, который обуславливает наследование резус-фактора (это цоликлон анти-D). Пятая лунка содержит контрольный реагент, который позволяет предотвратить возможные ошибки и грамотно определить принадлежность к группе крови.

Определение резус фактора экспресс методом с помощью стандартного универсального реагента без подогрева в пробирке

Для определения резус-фактора может быть использована свежая не свернувшаяся кровь, взятая из пальца непосредственно перед исследованием, или консервированная, без всякой предварительной обработки, а также эритроциты из пробирки после образования сгустка и отстаивания сыворотки.

Техника определения.

– 1мл стандартного универсального реагента (антирезусная сыворотка группы AB(IV)+33% раствор полиглюкина);

-1мл исследуемой крови(эритроцитов)

На дно пробирки внести 1 каплю стандартного универсального реагента и 1 каплю исследуемой крови (или эритроцитов).

Содержимое пробирки перемешать встряхиванием и затем медленно поворачивать, наклоняя пробирку почти до горизонтали таким образом, чтобы содержимое растекалось по её стенкам. после 3-минутного покачивания ,

для исключения неспецифической агрегации эритроцитов в пробирку добавить 2-3мл физиологического раствора хлористого натрия и перемешать, не взбалтывая, путём 2-3-х кратного перевёртывания пробирки. Оценку производить визуально.

Оценка результата.

Резус-(+) -наличие агглютинации в виде крупных хлопьев из эритроцитов на фоне просветлённой жидкости .

Резус-(-) -отсутствие агглютинации (в пробирке гомогенно окрашенная жидкость).

Определение резус-фактора с помощью моноклонального реагента (цоликлон анти-d , анти-d супер).

Цоликлон анти-D супер выпускается во флаконах по 2,5 или 10 мл (1 мл содержит 10 доз). Срок хранения — 1 год в холодильнике при t 2~8 °С. Вскрытый флакон можно хранить в холодильнике в течение месяца в закрытом виде

Наносят большую каплю (около 0,1 мл) реагента на пластинку или планшет.

Рядом помещают маленькую каплю (0,01-0,05 мл) исследуемой крови и смешивают кровь с реагентом.

Реакция агглютинации начинает развиваться через 10-15 сек, четко выраженная агглютинация наступает через 30-60 сек.

Результаты реакции считывают через 3 мин.

Тарелку после смешивания реагента с кровью рекомендуется покачивать не сразу, а через 20-30 сек, что позволяет за это время развиться более полной крупнолепестковой агглютинации.

Метод агглютинации на чашках Петри.

– исследуемые эритроциты;

-две серии стандартных сывороток антирезус всех групп системы АВО;

-контрольные образцы резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов:

-водяная баня с постоянной температурой 46-48 С°

-чашки Петри

Наличие агглютинации свидетельствует о положительном результате, отсутствие ее – об отрицательном. Для контроля в этом методе используют заведомо Rh-отрицательные и Rh-положительные эритроциты.

Метод агглютинации с 10% желатином:

Реакция конглютинации с желатиной обычно проводится в пробирках емкостью 8—10 мл. В штатив устанавливают 2 ряда пробирок для двух различных серий стандартной сыворотки. В контрольные пробирки каждого ряда вводят по 1 капле стандартных резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов, в остальные пары пробирок — исследуемые эритроциты. Исследование можно проводить как с отмытыми, так и с неотмытыми эритроцитами.

Затем в каждую пробирку добавляют по одной капле подогретой до разжижения желатины (10% раствор) и по одной капле стандартной сыворотки. Содержимое пробирок смешивают путем встряхивания и помещают в водяную баню при t° 46—48° на 5 мин., по истечении которых в каждую пробирку доливают 5—8 мл подогретого до t° 46—48° физиологического раствора NaCl и рассматривают на свет, определяя наличие или отсутствие агглютинации (рис. 2).

Метод агглютинации в солевой среде.

При исследовании сывороткой, содержащей полные антитела, применяют метод агглютинации в солевой среде в маленьких пробирках (высотой 2—2,5 см, диаметром 0,5 — 0,6 см).

В штатив устанавливают 2 ряда пробирок (по количеству исследуемых образцов и по 2 для контроля), в которые вводится по 2 капли стандартной сыворотки и по 1 капле 2% взвеси эритроцитов, предварительно дважды отмытых физиологическим раствором NaCl.

Содержимое пробирок встряхивают и помещают в термостат при t° 37° на 1 час.

О резус-принадлежности судят по форме осадка, который рассматривают через лупу с 5—7-кратным увеличением над источником света, закрытым матовым стеклом. Результаты учитывают в зависимости от наличия или отсутствия агглютинации в исследуемых эритроцитах после проверки контрольных образцов.

studopedia.ru

Расшифровка результатов

Проходит 5 минут, и можно оценивать результаты анализа. В больших каплях сыворотки наступает просветление, в одних образуются мелкие хлопья (реакция агглютинации), в других их нет. Здесь возможны варианты:

Ознакомьтесь со статьей:

• если агглютинации нет в обеих пробах с сыворотками III и II групп (+ контрольные 1 и 1V) — это первая группа;
• если свертывание отмечается во всех, кроме II — это указывает на вторую группу;
• при отсутствии агглютинации только с III сывороткой — устанавливается третья группа крови;
• если свертываемость отмечается во всех пробах, включая 1V-контрольную — группа четвертая.

Когда сыворотки расположены в правильном порядке, на тарелке проставлены подписи, то ориентироваться легко: где нет агглютинации, такая и группа.

Бывают случаи, когда склеивание видно неясно. Тогда анализ переделывают, мелкую агглютинацию смотрят под микроскопом.

Панели для идентификации антиэритроцитарных антител